求一篇关于酶的论文

改良碱性磷酸酶染色法

[日期：2008-08-11]来源：作者：乔海兵，邢开宇

【关键词】碱性磷酸酶染色法

1939年Gomori首次提出碱性磷酸酶组织化学染色法用于哺乳动物神经系统血管内皮，1951年Gomori修改了自已的方法，并称为“钙钴法”。1984年Bell在Gomori碱性磷酸酶染色法的基础上进行了改良，用于人脑海马和距状裂区的毛细血管取得成功〔1〕。本文以Bell法为基础，对其法的某些步骤进行了简化和改良，应用于脑微血管的研究，同时可以显示出脑微动脉、微静脉。现将此法介绍如下。

1原理

此方法为金属阳离子沉淀法。以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，光镜下呈黑色〔2〕。

2方法

2.1取材

标本在24h内取出,切成2cm×2cm×2cm的组织块，放入4℃冰箱中保存。尽快放入固定液中固定24h以上。

新鲜固定液的配制：无水氯化钙5g；巴比妥纳2.5g；纯甲醛液5ml；蒸馏水488ml。

2.2脱水

组织固定好之后，移入70％的酒精24h，依次移入85％酒精4h，无水酒精，丙酮(1∶1)溶液4h，无水酒精,乙醚(1∶1)溶液中4h。

2.3包埋

将脱水之后的组织块修整，移入5％的火棉胶溶液中浸泡包埋，放入4℃冰箱中，1周后可成块。

2.4切片

切片厚度在60μm左右，置入75％酒精中。

2.5孵化

将切片放入孵化液中，在37℃恒温箱内孵化2h～4h。孵化液的配制：β甘油磷酸钠1.2g;无水氯化钙1.96g;巴比妥钠1g;蒸馏水200ml。

2.6染色

将孵化好的切片快速更换3次蒸馏水，马上置入1.5％硝酸铅溶液中5min，快速更换3次蒸馏水，然后放入2％硫化铵溶液中3min，再快速更换3次蒸馏水。

2.7裱片、脱水、封片

裱片后脱水二甲苯透明封片。

3改良措施

取材要新鲜以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。固定液和孵化液配好之后，可不调其pH值，只需用pH试纸测试固定液呈弱酸性，孵化液呈弱酸性即可。包埋过程中应用梯度包埋法，火棉胶浓度最高不能超过10％。先将组织块放入5％的火棉胶溶液中，留一小开口，置入4℃冰箱中，以利于酒精挥发，每天给容器加满火棉胶。2d～3d后改换10％的火棉胶，直至包埋好为止。包埋好的组织块应硬度适宜，用手指轻按可留有指纹，但不易碎。孵化过程适当延长，以利于内皮细胞碱性磷酸酶与孵化液充分反应。在裱片过程中由于切片较厚，切片很容易脱落。可采用先透明后封片的办法，既不影响切片的透明度，片子也不容易脱落。

4讨论

碱性磷酸酶染色属于组化呈色法，由于此法对微血管显色均匀、充分，并可较好的反映正常微血管的自然扩张状态，有效地避免了血管灌注法的种种缺憾，而且此法经多次改良，使操作方法更为简单，呈色时间缩短，因而成为目前较为流行的一种微血管形态学的研究方法〔3〕。但Hunzlker等认为，由于小静脉内皮细胞碱性磷酸酶分布不集中，活性较低，因而微静脉难以显示。我们在研究过程中对碱性磷酸酶法进一步改良之后，可显示大量的带有三角形膨大的血管(见图1)，而这一特点正是微静脉所特有的，所以我们认为，并非微静脉用此法不能显示，而是在实验过程中pH值、温度掌握不准所致。

参考文献：

〔1〕王有伟，陈以慈.碱性磷酸酶染色法(钙铅法)在研究人脑和心脏微血管方面的应用〔J〕.解剖学杂志，9(3)：227.

〔2〕杜卓民．实用组织学技术〔M〕.北京：人民卫生版社，1982：309.

〔3〕张为龙.脑血管研究近况〔J〕.临床解剖学杂志，1986，4：118.