怎样判断虾有没有孢子虫

我们应用PCR技术，放大EHP的18SrRNA基因，再用标记地可辛的探针探测原位杂交细胞中被感染的EHP，最后开发新的PCR技术探测对虾组织，排泄物和水中的EHP。

2.材料和方法

2.1对虾

2006年在文莱收集了感染对虾肠孢子虫（EHP）的南美兰对虾。

2014年和2015年在越南虾塘里收集了感染EHP的南美白对虾。

2014年，从泰国运送了一批南美兰对虾到我们亚利桑那大学的实验室进行隔离检测，这些对虾后来被检测出感染了EHP，它们的肝胰腺，排泄物和水进行了PCR技术取样检测。

为了检测原位杂交（ISH），并通过PCR技术分析EHP的特异性，研究人员使用了具有棉虾病临床症状的斑节对虾样本，这些对虾来自2005年（固定组织）和2006年（冰冻组织）的马达加斯加。还使用了感染了鳄组织变形虫的南美白对虾，这些虾是在2014年收集到的。通过PCR技术分析，肝胰腺组织或者整只对虾被保护在95%的酒精当中或被风干后送往我们实验室。通过原位杂交技术，用戴维森固定法将虾固定。

2.2.DNA提取

从感染EHP的对虾中去除肝胰腺，（4-5只虾）放进一个样本中。装运感染EHP的对虾的虾槽中对排泄物和水进行了取样。利用MicrosepAdvance离心装置（PALL公司）将虾槽里的水浓缩150倍，用于DNA提取。用一种高纯度DNA模板制备工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell LEV DNA纯化试剂盒（Promega）。

为了测试EHP引物的特异性，PCR扩增检测两种寄生虫病中的DNA：

（1）棉虾病，2006年从马达加斯加收集了斑节对虾，这些虾的肌肉变白，通过rRNA基因测序，发现它们的DNA呈阴性，因为内有类似于匹里虫的微孢子虫（GenBankkp825331号）；

（2）变形虫病，这些南美白对虾大量死亡，通过组织学检查，最后发现这些虾感染了变形虫（种类不确定）。

为了保证EHP引物没有宿主基因组的反应，制备DNA模板：

（1）来自美国夏威夷的无特定病原（SPF）的南美白对虾（>10样本）、斑节对虾（3个样本）；

（2）来自沙特阿拉伯的印度对虾（2个样本）；

（3）在新喀里多尼亚养殖的南美兰对虾（2个样本）；

（4）来自菲律宾的罗氏沼虾（2个样本）；

（5）沙特阿拉伯附近虾塘里采集的蟹（7个样本，未知的物种）；

（6）多毛