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质粒层析纯化的基本原理

发表时间：2024-08-01 09:32:20 来源：网友投稿

溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。

由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来氯化铯——溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。但是该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱基性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽提到的质量DNA可用于酶切、连接和转化。对于分子量较大拷贝较少对的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，所以选用吕华铯密度超高离心法抽提DNA，且具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质量DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用少量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。最新方法最近已得到改进（R.Treisman,个人通讯）并达到较高境界，使用该方法可得到极高纯度的质粒。聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯——溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同，那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开，所以纯化容易带上切口的极大质粒（大于15kb）。用于生物物理学测定的闭环质粒时，平衡离心仍是首选的方法。但是两种纯化方法都可得到足以胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA，包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。氯化铯——溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA。

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